Введение
L-фенилацетилкарбинол - это соединение, используемое в синтезе эфедрина, который сам по себе является предшественником амфетаминов. В промышленности его синтезируют путем аэробной ферментации бензальдегида пекарскими дрожжами (S. cerevisiae/SC). Хотя процесс довольно прост, он может потребовать определенного оборудования и знаний, особенно если речь идет о поддержании стерильных культур и надлежащих условий роста. Поэтому я расскажу о двух различных по сложности методах получения L-PAC путем биотрансформации. Перед использованием ростовую среду следует стерилизовать в автоклаве.
Первый метод:
Этот метод можно охарактеризовать как "небрежно, но легко". Она требует меньше оборудования, проще, но при этом менее эффективна и приводит к снижению урожайности.
Процедура:
В 500 мл стерильного 0,1 М цитратного буфера pH 6 добавьте 44 г дрожжей и 55 г глюкозы. Поместите в водяную баню, нагретую до 30°C. Инкубируйте в течение 40/50 минут.
Добавьте бензальдегид (25 ммоль) в 5 мл этанола и ацетальдегид (25 ммоль). Инкубируйте в течение 60 минут.
Отфильтруйте через целит.
Экстрагируйте 3*100 мл этилацетата. Разбейте эмульсию насыщенным раствором хлорида натрия, высушите над безводным сульфатом натрия, отфильтруйте, выпарьте растворитель. Это и есть ваш L-PAC.
Пояснения:
Цитратный буфер: он используется для поддержания стабильного pH, так как рост клеток со временем понижает его (что не очень хорошо). Чтобы приготовить этот буфер, следуйте процедурам, приведенным в этом калькуляторе: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Не забудьте изменить pH до 6.
Температура: позволяет повысить метаболическую активность дрожжей.
Этанол: используется для растворения бензальдегида и ацетальдегида и повышает их биодоступность.
Ацетальдегид: используется в качестве акцептора водорода вместо бензальдегида, тем самым ограничивая производство бензилового спирта.
Это простая процедура, которой может следовать практически каждый, прочитав немного о стандартных стерильных методах, но она дает более низкий выход, чем другая (от 20 до 40 %). Ее можно улучшить либо за счет лучшей аэрации с помощью орбитального встряхивания при 150 об/мин, либо за счет нагнетания стерильного воздуха в среду из расчета 1 л воздуха на литр среды в минуту, либо за счет иммобилизации клеток в альгинатных шариках. Вы можете посмотреть об этом на youtube, это очень легко сделать, и это может значительно увеличить урожайность.
Второй метод:
Этот протокол более сложный, но при правильном выполнении может увеличить выход до 60 или 70 %. Однако он требует больше материала. Хотя он и не идеален, но гораздо лучше.
Этот метод был разработан для дрожжей Candida utilis, а не S. cerevisiae. Вы можете использовать SC вместо них, но при этом снизится урожайность. Купить C. utilis можно здесь: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Процедура
Ростовая среда состоит из 10 г/л мочевины (вносит азот), 10 г/л MgSO4 (вносит магний и серу) и от 50 до 70 г/л сахара, используемого в качестве патоки. Растворите в достаточном объеме 0,1 М цитратного буфера pH 6.
За день до этого внесите стартовую культуру дрожжей и инкубируйте при 30°C в течение ночи.
Измерьте оптическую плотность (абсорбцию) при 595 нм. Инокулируйте реактор для ферментации 15 % v/v исходной культуры, доведенной до 0,4 OD. Пример: для инокуляции емкости объемом 1 л, если OD была измерена на уровне 0,2, добавьте 300 мл к 700 мл. Если OD уже 0,4, добавьте 150 мл к 850 мл и т.д... (240x106 клеток/мл в инокуляте, см. пояснения).
Инкубируйте при 30°C либо при орбитальном встряхивании со скоростью 150 об/мин, либо при откачивании стерильного воздуха со скоростью 1 в/в/мин. Если воздух нагнетается, можно добавить медленное перемешивание.
Инкубируйте до тех пор, пока OD не достигнет 0,3-0,4. Это должно занять от 4 до 6 часов, может быть меньше или больше. Проверяйте OD каждые 30 минут, пока не достигнете желаемого значения.
Добавление бензальдегида производится в несколько доз. Для 50 мл объемы составляют 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Одновременно добавьте эквивалентный объем ацетальдегида. Подождите один час между каждым добавлением.
Экстрагируйте, используя 1:2 толуол/средство v/v, выпарьте.
Пояснения:
Оптическая плотность: измеряется с помощью спектрофотометра. Здесь мы читаем поглощение при 595 нм, которое пропорционально количеству клеток в растворе. Как правило, помните, что 0,1 OD=60x10^6 клеток/мл.
Общие замечания:
Для аэрации в небольших масштабах лучше использовать орбитальное встряхивание при 150 об/мин. В более крупных масштабах вам понадобится воздух, пропущенный через фильтр.
Во втором протоколе добавление бензальдегида осуществляется в нескольких дозах для повышения урожайности. Это можно еще больше улучшить, если непрерывно вводить бензальдегид с уменьшающейся скоростью, но это сложно сделать в любительских условиях.
Можно использовать замещенные бензальдегиды, которые дадут соответствующий аналог L-PAC.
Наконец, вы можете позаимствовать некоторые элементы метода 2 и включить их в метод 1, чтобы настроить экспериментальную схему по своему вкусу. Имейте в виду, что можно использовать другие штаммы и виды, что значительно увеличит выход. Более подробную информацию см. в статье "Производство L-фенилацетилкарбинола (L-PAC) различными новыми штаммами дрожжей на мелассе и соке сахарного тростника в качестве производственной среды" (Ravi et al.).
L-фенилацетилкарбинол - это соединение, используемое в синтезе эфедрина, который сам по себе является предшественником амфетаминов. В промышленности его синтезируют путем аэробной ферментации бензальдегида пекарскими дрожжами (S. cerevisiae/SC). Хотя процесс довольно прост, он может потребовать определенного оборудования и знаний, особенно если речь идет о поддержании стерильных культур и надлежащих условий роста. Поэтому я расскажу о двух различных по сложности методах получения L-PAC путем биотрансформации. Перед использованием ростовую среду следует стерилизовать в автоклаве.
Первый метод:
Этот метод можно охарактеризовать как "небрежно, но легко". Она требует меньше оборудования, проще, но при этом менее эффективна и приводит к снижению урожайности.
Процедура:
В 500 мл стерильного 0,1 М цитратного буфера pH 6 добавьте 44 г дрожжей и 55 г глюкозы. Поместите в водяную баню, нагретую до 30°C. Инкубируйте в течение 40/50 минут.
Добавьте бензальдегид (25 ммоль) в 5 мл этанола и ацетальдегид (25 ммоль). Инкубируйте в течение 60 минут.
Отфильтруйте через целит.
Экстрагируйте 3*100 мл этилацетата. Разбейте эмульсию насыщенным раствором хлорида натрия, высушите над безводным сульфатом натрия, отфильтруйте, выпарьте растворитель. Это и есть ваш L-PAC.
Пояснения:
Цитратный буфер: он используется для поддержания стабильного pH, так как рост клеток со временем понижает его (что не очень хорошо). Чтобы приготовить этот буфер, следуйте процедурам, приведенным в этом калькуляторе: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Не забудьте изменить pH до 6.
Температура: позволяет повысить метаболическую активность дрожжей.
Этанол: используется для растворения бензальдегида и ацетальдегида и повышает их биодоступность.
Ацетальдегид: используется в качестве акцептора водорода вместо бензальдегида, тем самым ограничивая производство бензилового спирта.
Это простая процедура, которой может следовать практически каждый, прочитав немного о стандартных стерильных методах, но она дает более низкий выход, чем другая (от 20 до 40 %). Ее можно улучшить либо за счет лучшей аэрации с помощью орбитального встряхивания при 150 об/мин, либо за счет нагнетания стерильного воздуха в среду из расчета 1 л воздуха на литр среды в минуту, либо за счет иммобилизации клеток в альгинатных шариках. Вы можете посмотреть об этом на youtube, это очень легко сделать, и это может значительно увеличить урожайность.
Второй метод:
Этот протокол более сложный, но при правильном выполнении может увеличить выход до 60 или 70 %. Однако он требует больше материала. Хотя он и не идеален, но гораздо лучше.
Этот метод был разработан для дрожжей Candida utilis, а не S. cerevisiae. Вы можете использовать SC вместо них, но при этом снизится урожайность. Купить C. utilis можно здесь: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Процедура
Ростовая среда состоит из 10 г/л мочевины (вносит азот), 10 г/л MgSO4 (вносит магний и серу) и от 50 до 70 г/л сахара, используемого в качестве патоки. Растворите в достаточном объеме 0,1 М цитратного буфера pH 6.
За день до этого внесите стартовую культуру дрожжей и инкубируйте при 30°C в течение ночи.
Измерьте оптическую плотность (абсорбцию) при 595 нм. Инокулируйте реактор для ферментации 15 % v/v исходной культуры, доведенной до 0,4 OD. Пример: для инокуляции емкости объемом 1 л, если OD была измерена на уровне 0,2, добавьте 300 мл к 700 мл. Если OD уже 0,4, добавьте 150 мл к 850 мл и т.д... (240x106 клеток/мл в инокуляте, см. пояснения).
Инкубируйте при 30°C либо при орбитальном встряхивании со скоростью 150 об/мин, либо при откачивании стерильного воздуха со скоростью 1 в/в/мин. Если воздух нагнетается, можно добавить медленное перемешивание.
Инкубируйте до тех пор, пока OD не достигнет 0,3-0,4. Это должно занять от 4 до 6 часов, может быть меньше или больше. Проверяйте OD каждые 30 минут, пока не достигнете желаемого значения.
Добавление бензальдегида производится в несколько доз. Для 50 мл объемы составляют 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Одновременно добавьте эквивалентный объем ацетальдегида. Подождите один час между каждым добавлением.
Экстрагируйте, используя 1:2 толуол/средство v/v, выпарьте.
Пояснения:
Оптическая плотность: измеряется с помощью спектрофотометра. Здесь мы читаем поглощение при 595 нм, которое пропорционально количеству клеток в растворе. Как правило, помните, что 0,1 OD=60x10^6 клеток/мл.
Общие замечания:
Для аэрации в небольших масштабах лучше использовать орбитальное встряхивание при 150 об/мин. В более крупных масштабах вам понадобится воздух, пропущенный через фильтр.
Во втором протоколе добавление бензальдегида осуществляется в нескольких дозах для повышения урожайности. Это можно еще больше улучшить, если непрерывно вводить бензальдегид с уменьшающейся скоростью, но это сложно сделать в любительских условиях.
Можно использовать замещенные бензальдегиды, которые дадут соответствующий аналог L-PAC.
Наконец, вы можете позаимствовать некоторые элементы метода 2 и включить их в метод 1, чтобы настроить экспериментальную схему по своему вкусу. Имейте в виду, что можно использовать другие штаммы и виды, что значительно увеличит выход. Более подробную информацию см. в статье "Производство L-фенилацетилкарбинола (L-PAC) различными новыми штаммами дрожжей на мелассе и соке сахарного тростника в качестве производственной среды" (Ravi et al.).
