Introducción
El L-fenilacetilcarbinol es un compuesto utilizado en la síntesis de la efedrina, a su vez utilizada como precursor de las anfetaminas. Industrialmente, se sintetiza mediante la fermentación aeróbica del benzaldehído por la levadura de panadería (S. cerevisiae/SC). Aunque el proceso es bastante sencillo, puede requerir un poco de equipo y conocimientos, sobre todo cuando se habla de mantener cultivos estériles y condiciones de crecimiento adecuadas. Por ello, explicaré dos métodos de diferente sofisticación para la producción de L-PAC mediante biotransformación. El medio de crecimiento debe esterilizarse en autoclave antes de su uso.
Primer método:
Se podría describir esta técnica como "chapucera pero fácil". Requiere menos equipo, es más fácil, pero también es menos eficaz y dará lugar a rendimientos más bajos.
Procedimiento:
En 500 ml de tampón citrato estéril 0,1 M pH 6, añadir 44 g de levadura y 55 g de glucosa. Colocar en un baño maría calentado a 30°C. Incubar durante 40/50 minutos.
Añadir benzaldehído (25 mmol) en 5 mL de etanol y acetaldehído (25 mmol). Incubar durante 60 minutos.
Filtrar a través de Celite.
Extraer con 3*100 ml de acetato de etilo. Romper la emulsión con una solución saturada de cloruro sódico, secar sobre sulfato sódico anhidro, filtrar y evaporar el disolvente. Este es su L-PAC.
Explicaciones:
Tampón citrato: se utiliza para mantener un pH estable, ya que el crecimiento de la célula lo disminuirá con el tiempo (no es bueno). Para preparar este tampón, sigue los procedimientos indicados en esta calculadora: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. No olvides cambiar el pH a 6.
Temperatura: permite una mayor actividad metabólica de la levadura.
Etanol: se utiliza para disolver el benzaldehído y el acetaldehído y aumenta su biodisponibilidad.
Acetaldehído: se utiliza como aceptor de hidrógeno en lugar del benzaldehído, limitando así la producción de alcohol bencílico.
Se trata de un procedimiento fácil que casi cualquiera puede seguir tras un poco de lectura sobre técnicas estériles estándar, pero da rendimientos más bajos que el otro (entre el 20 y el 40%). Se puede mejorar con una mejor aireación mediante agitación orbital a 150 rpm o bombeando aire estéril en el medio, con 1 litro de aire por litro de medio por minuto, o inmovilizando las células en perlas de alginato. Puedes buscar esto en youtube, es muy fácil de hacer, y puede aumentar los rendimientos de manera significativa.
Segundo método:
Este protocolo es más avanzado, pero puede aumentar los rendimientos hasta un 60 o 70% si se hace correctamente. Sin embargo, requiere más material. Aunque no es perfecto, es mucho mejor.
Este método fue diseñado para la levadura Candida utilis en lugar de S. cerevisiae. Puede utilizar SC en su lugar, pero verá una disminución en los rendimientos. Puedes comprar C. utilis aquí: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedimiento
El medio de cultivo se compone de 10g/L de urea (aporta nitrógeno), 10g/L de MgSO4 (aporta magnesio y azufre) y entre 50 y 70g/L de azúcar utilizando melaza. Disolver en un volumen adecuado de tampón citrato 0,1M pH 6.
La víspera, inocular un cultivo inicial de levadura e incubar a 30°C durante la noche.
Leer la densidad óptica (absorbancia) a 595 nm. Inocular el reactor de fermentación con un 15% v/v del cultivo inicial ajustado a 0,4 DO. Ejemplo: para inocular un recipiente de 1L, si la DO se midió a 0,2, añada 300mL a 700mL. Si la DO ya está en 0,4, añadir 150mL a 850mL etc... (240x106 células/ml en el inóculo, ver explicaciones)
Incubar a 30°C con agitación orbital a 150 rpm o bombeando aire estéril a una velocidad de 1 v/v/min. Si se bombea aire, se puede añadir un poco de agitación lenta.
Incubar hasta que la DO alcance entre 0,3 y 0,4. Esto debería llevar entre 4 y 6 horas. Esto debería llevar entre 4 y 6 horas, puede ser menos o más. Comprueba la DO cada 30 minutos hasta que alcances el valor deseado.
La adición de benzaldehído se hace en dosis múltiples. Para un 50mL, los volúmenes son 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Añadir al mismo tiempo un volumen equivalente de acetaldehído. Esperar una hora entre cada adición.
Extraer utilizando 1:2 tolueno/medio v/v, evaporar.
Explicación:
Densidad óptica: se mide con un espectrofotómetro. Aquí se lee la absorbancia a 595 nm, que es proporcional al número de células en la solución. Como regla general, recuerde que 0,1 DO=60x10^6 células/mL.
Notas generales:
Para la aireación, a pequeña escala es mejor la agitación orbital a 150 rpm. A mayor escala, necesitarás burbujear aire pasado por un filtro.
En el segundo protocolo, la adición de benzaldehído se hace en dosis múltiples para aumentar los rendimientos. Esto se puede mejorar aún más inyectando continuamente benzaldehído en dosis decrecientes, pero esto es complejo de hacer en un entorno amateur.
Se pueden utilizar benzaldehídos sustituidos y se obtendrá el análogo de L-PAC correspondiente.
Por último, puedes tomar prestados algunos elementos del método 2 e incorporarlos al método 1 para personalizar el diseño experimental a tu gusto. Tenga en cuenta que pueden utilizarse otras cepas y especies, lo que aumentará considerablemente los rendimientos. Para más información, véase "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" de Ravi et al.
El L-fenilacetilcarbinol es un compuesto utilizado en la síntesis de la efedrina, a su vez utilizada como precursor de las anfetaminas. Industrialmente, se sintetiza mediante la fermentación aeróbica del benzaldehído por la levadura de panadería (S. cerevisiae/SC). Aunque el proceso es bastante sencillo, puede requerir un poco de equipo y conocimientos, sobre todo cuando se habla de mantener cultivos estériles y condiciones de crecimiento adecuadas. Por ello, explicaré dos métodos de diferente sofisticación para la producción de L-PAC mediante biotransformación. El medio de crecimiento debe esterilizarse en autoclave antes de su uso.
Primer método:
Se podría describir esta técnica como "chapucera pero fácil". Requiere menos equipo, es más fácil, pero también es menos eficaz y dará lugar a rendimientos más bajos.
Procedimiento:
En 500 ml de tampón citrato estéril 0,1 M pH 6, añadir 44 g de levadura y 55 g de glucosa. Colocar en un baño maría calentado a 30°C. Incubar durante 40/50 minutos.
Añadir benzaldehído (25 mmol) en 5 mL de etanol y acetaldehído (25 mmol). Incubar durante 60 minutos.
Filtrar a través de Celite.
Extraer con 3*100 ml de acetato de etilo. Romper la emulsión con una solución saturada de cloruro sódico, secar sobre sulfato sódico anhidro, filtrar y evaporar el disolvente. Este es su L-PAC.
Explicaciones:
Tampón citrato: se utiliza para mantener un pH estable, ya que el crecimiento de la célula lo disminuirá con el tiempo (no es bueno). Para preparar este tampón, sigue los procedimientos indicados en esta calculadora: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. No olvides cambiar el pH a 6.
Temperatura: permite una mayor actividad metabólica de la levadura.
Etanol: se utiliza para disolver el benzaldehído y el acetaldehído y aumenta su biodisponibilidad.
Acetaldehído: se utiliza como aceptor de hidrógeno en lugar del benzaldehído, limitando así la producción de alcohol bencílico.
Se trata de un procedimiento fácil que casi cualquiera puede seguir tras un poco de lectura sobre técnicas estériles estándar, pero da rendimientos más bajos que el otro (entre el 20 y el 40%). Se puede mejorar con una mejor aireación mediante agitación orbital a 150 rpm o bombeando aire estéril en el medio, con 1 litro de aire por litro de medio por minuto, o inmovilizando las células en perlas de alginato. Puedes buscar esto en youtube, es muy fácil de hacer, y puede aumentar los rendimientos de manera significativa.
Segundo método:
Este protocolo es más avanzado, pero puede aumentar los rendimientos hasta un 60 o 70% si se hace correctamente. Sin embargo, requiere más material. Aunque no es perfecto, es mucho mejor.
Este método fue diseñado para la levadura Candida utilis en lugar de S. cerevisiae. Puede utilizar SC en su lugar, pero verá una disminución en los rendimientos. Puedes comprar C. utilis aquí: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedimiento
El medio de cultivo se compone de 10g/L de urea (aporta nitrógeno), 10g/L de MgSO4 (aporta magnesio y azufre) y entre 50 y 70g/L de azúcar utilizando melaza. Disolver en un volumen adecuado de tampón citrato 0,1M pH 6.
La víspera, inocular un cultivo inicial de levadura e incubar a 30°C durante la noche.
Leer la densidad óptica (absorbancia) a 595 nm. Inocular el reactor de fermentación con un 15% v/v del cultivo inicial ajustado a 0,4 DO. Ejemplo: para inocular un recipiente de 1L, si la DO se midió a 0,2, añada 300mL a 700mL. Si la DO ya está en 0,4, añadir 150mL a 850mL etc... (240x106 células/ml en el inóculo, ver explicaciones)
Incubar a 30°C con agitación orbital a 150 rpm o bombeando aire estéril a una velocidad de 1 v/v/min. Si se bombea aire, se puede añadir un poco de agitación lenta.
Incubar hasta que la DO alcance entre 0,3 y 0,4. Esto debería llevar entre 4 y 6 horas. Esto debería llevar entre 4 y 6 horas, puede ser menos o más. Comprueba la DO cada 30 minutos hasta que alcances el valor deseado.
La adición de benzaldehído se hace en dosis múltiples. Para un 50mL, los volúmenes son 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Añadir al mismo tiempo un volumen equivalente de acetaldehído. Esperar una hora entre cada adición.
Extraer utilizando 1:2 tolueno/medio v/v, evaporar.
Explicación:
Densidad óptica: se mide con un espectrofotómetro. Aquí se lee la absorbancia a 595 nm, que es proporcional al número de células en la solución. Como regla general, recuerde que 0,1 DO=60x10^6 células/mL.
Notas generales:
Para la aireación, a pequeña escala es mejor la agitación orbital a 150 rpm. A mayor escala, necesitarás burbujear aire pasado por un filtro.
En el segundo protocolo, la adición de benzaldehído se hace en dosis múltiples para aumentar los rendimientos. Esto se puede mejorar aún más inyectando continuamente benzaldehído en dosis decrecientes, pero esto es complejo de hacer en un entorno amateur.
Se pueden utilizar benzaldehídos sustituidos y se obtendrá el análogo de L-PAC correspondiente.
Por último, puedes tomar prestados algunos elementos del método 2 e incorporarlos al método 1 para personalizar el diseño experimental a tu gusto. Tenga en cuenta que pueden utilizarse otras cepas y especies, lo que aumentará considerablemente los rendimientos. Para más información, véase "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" de Ravi et al.
